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腺嘌呤(Adenine)酶联免疫(ELISA)试剂盒使用说明书

本试剂仅供研究使用，不得用于临床诊断                          规格：96T

实验目的：

本试剂盒用于测定测定相关液体样本中腺嘌呤(Adenine)的含量。

实验原理：

本试剂盒应用酶联免疫竞争法测定标本中腺嘌呤(Adenine)水平。用纯化的腺嘌呤(Adenine)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入腺嘌呤(Adenine)，和HRP标记的腺嘌呤(Adenine)抗原，使它们竞争结合，，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。样本颜色的深浅和样品中的腺嘌呤(Adenine)的含量呈负相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中腺嘌呤(Adenine)的含量。

试剂盒组成：

样本处理及要求：

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5.组织标本：切割标本后，称取重量1g，加入9ml的PBS、PH7.4，匀浆的比例1:9，匀浆液选取PBS（PH=7.2-7.4，浓度为0.01mol/L）。离心20分钟左右（3000-5000转/分），仔细收集上清。

6.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

需自备的仪器耗材：

1.酶标仪（450nm）

2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

操作步骤：

1、加样：分别设标准孔、空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上标准孔中加50微升，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
2、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

3、温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
4、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

5、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6、显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

7、终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
8、测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。 

计算：

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 

检测范围：

1 μg/L  -  70 μg/L

保存条件及有效期：

1. 试剂盒保存：2-8℃。

2．有效期： 6个月

注意事项：

1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。样本在使用前也要在室温平衡30分钟。

2. 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。

5. 本试剂不同批号组分不得混用，底物请避光保存。

6. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

7. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

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